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超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒說明書 |
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超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒說明書 可見分光光度法 測(cè)定意義：
SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子 發(fā)生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成 酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
測(cè)定原理：
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.)，O2-.可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在 560nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深， 說明 SOD 活性愈低，反之活性越高。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：15mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存，用時(shí)加入27ml蒸餾水，充分搖勻懸濁液； 試劑三：液體 175μL×1 支，4℃保存；(與蒸餾水1：1稀釋后再使用)
試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備： 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 560nm，蒸餾水調(diào)零。
2、測(cè)定前將試劑一、二和四 37℃（哺乳動(dòng)物）25℃（其他物種）水浴 5min 以上。 3、樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：
充分混勻，室溫靜置 30min 后，加入 1mL 玻璃比色皿，560nm 處測(cè)定各管吸光值 A。 注意事項(xiàng)：
1、試劑三為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置。
2、對(duì)照管只需要做一管。
SOD 活性計(jì)算：
1、抑制百分率的計(jì)算
抑制百分率＝(A 對(duì)照管－A 測(cè)定管) ÷A 對(duì)照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 30-70%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于 30%或大于 70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用 提取液適當(dāng)稀釋；如果測(cè)定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本。 2、SOD 酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí)，反應(yīng)體系 中的 SOD 酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。
3、SOD 酶活性計(jì)算：
（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣×樣本稀釋倍數(shù)=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)×樣本稀釋倍數(shù)
（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 SOD 活力計(jì)算： a.按樣本蛋白濃度計(jì)算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)×樣本稀釋倍數(shù)
=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr×樣本稀釋倍數(shù) 需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。 b.按樣本鮮重計(jì)算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)×樣本稀釋 倍數(shù)=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W×樣本稀釋倍數(shù)
c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)×樣本稀釋 倍數(shù)=0.0228×抑制百分率÷(1－抑制百分率)×樣本稀釋倍數(shù)
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.026mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.09mL；V 樣總： 加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或 細(xì)菌總數(shù)，500 萬 |
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