呋喃妥因代謝物 快速檢測試劑盒說明書 一、原理 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃妥因代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物呋喃妥因代謝物的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃妥因代謝物的含量。 二、試劑盒特性 - 試劑盒靈敏度： 0.04ppb
- 孵育溫度： 25℃
- 孵育時間： 30min~15min
- 樣本檢測下限
肌肉組織 ································· 0.1ppb 雞蛋 ······································· 0.1ppb 蜂蜜 ········································· 0.1ppb 呋喃妥因代謝物 ································· 100% 呋喃唑酮代謝物 ······························· ＜0.1% 呋喃它酮代謝物 ······························· ＜0.1% 呋喃西林代謝物 ······························· ＜0.1% 肌肉組織 ································· 95%±25% 雞蛋 ······································ 95%±25% 蜂蜜 ······································· 75%±25% 三、試劑盒組成 1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | 2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.04ppb | 0.12ppb | 0.36ppb | 1.08ppb | 3.24ppb | 3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 | 4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 | 5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 | 6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 | 7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 | 8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 | 9 | 2X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 | 10 | 衍生化試劑 | 10ml | 白色帽 |
四、所用儀器、試劑 具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋 微量移液器：單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl 試 劑：氫氧化鈉、K2HPO4·3H2O、正己烷、乙酸乙酯、濃HCl 五、樣本前處理步驟 （a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。 （b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。 配液1 0.1M K2HPO4溶液： 稱11.4g K2HPO4·3H2O加去離子水溶解定溶至500ml。 配液2 1M HCl 溶液： 取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。 配液3 1M NaOH溶液： 稱4g NaOH加去離子水定容至100ml 配液4 樣本復(fù)溶液： 將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。 （a）肌肉、雞蛋樣本處理方法 - 稱取1±0.05g的均質(zhì)物，分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min；
- 在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；
- 分別加入5ml 0.1M K2HPO4溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；
- 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）；
- 取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。
- 用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復(fù)離心）；
- 取50µl下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2倍 （b）蜂蜜樣本處理方法 - 稱取2±0.05g的均質(zhì)物（蜂蜜），分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min；
- 在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；
- 分別加入5ml 0.1M K2HPO4溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；
- 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）；
- 取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。
- 用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復(fù)離心）；
- 取50µl下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍 六、 酶標(biāo)免疫分析程序: - 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
- 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
- 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
- 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
- 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
- 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
- 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
- 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用di1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃妥因代謝物量成負相關(guān)。 1、粗略判定： 用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.04pb為1.816；0.12ppb為1.415；0.36ppb為0.74；1.08ppb為0.313；3.24ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是1.08ppb～3.24ppb；樣本2的濃度范圍是0.12ppb～0.36ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實際濃度。 2、定量分析 （1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即 B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 （2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實際濃度。 若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來索取） 八、 注意事項 - 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
- 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
- 該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期 - 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
- 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。 實驗代做服務(wù)： |
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