ATP含量試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ATP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測定ATP含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測定原理：

肌酸激酶催化肌酸和ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸，可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測磷酸肌酸含量，以此反應(yīng)ATP含量。

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 堿性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1 支，4℃保存；臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存；

試劑二：液體 1.5mL×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存； 試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)液：液體 10mL×1 瓶，2μmol/mLATP 標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存；

ATP 提取：

1、血清（漿）中ATP的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min；取上清液至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g4 ℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

2、組織中 ATP 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中ATP的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 酸性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，超聲2s，停1s），8000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到700nm，蒸餾水調(diào)零。

2、顯色劑的配制：臨用前請根據(jù)擬用顯色劑體積（樣本數(shù)×0.2 mL），按試劑四(mL)：試劑五（mL）=1：5 的比例配制。用多少配多少。

3、樣本測定：

37℃水浴20min后，700nm下測定各管吸光值

注意 ：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個。每個測定管設(shè)一個對照管。

ATP 含量計算：

1、血清（漿）中ATP含量計算

ATP含量(μmol/mL)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)×V1]÷(V3×V1÷ V2)=40×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP含量計算

（1） 按蛋白濃度計算

ATP含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)×V1]÷(V1÷ Cpr）=2×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

（2） 按樣本鮮重計算

ATP含量（μmol/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)×V1]÷(W×V1÷ V2)=4×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

ATP含量(μmol/104cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)×V1]÷(500× V1÷V2)=0.008×(A測定管－A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，2μmol/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

注意：低檢測限為 10nmol/mL 或10nmol/g鮮重或 0.1nmol/mg prot

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