雙熒光素酶報告基因檢測
實驗意義
1.可廣泛引用與miRNA的靶基因檢測，可以判斷miRNA是否與靶基因結(jié)合，也可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。
2.轉(zhuǎn)錄因子(反式作用因子)存在DNA結(jié)合域，可以與靶標啟動子中的特異序列(順式作用元件)進行共價結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達，雙熒光素酶報告系統(tǒng)是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子與基因特異序列的重要手段，是真核基因表達調(diào)控研究的常用方法。
實驗原理及流程
雙熒光素酶是指螢火熒光素酶和海腎熒光素酶，螢火蟲熒光素酶呈黃綠色，波長550-570nm, 海腎熒光素酶呈藍色，波長為480nm。報告基因?qū)嶒炇菍袠藛幼拥奶囟ㄆ尾迦霟晒馑孛副磉_序列的前方，構(gòu)建帶有靶標啟動子片段的雙報道基因質(zhì)粒，然后將待測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或者其他相關(guān)細胞系，如果轉(zhuǎn)錄因子能夠激活
啟動子，則報告基因表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子作用強度成正比。加入熒光素酶底物即可根據(jù)熒光強度檢測轉(zhuǎn)錄因子與靶啟動子之間是否存在相互作用。熒光素酶報告基因可構(gòu)建在同一質(zhì)粒或者構(gòu)建為兩個質(zhì)粒，即轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒與靶啟動子片段質(zhì)粒。
實驗完成周期及交付標準
實驗周期: 4-6周
交付標準: 雙熒光素酶報告基因檢測、鑒定結(jié)果報告、分析報告、實驗報告(試劑、 耗材.實驗步驟)、原始數(shù)據(jù)等
需確認的信息
1.基因與啟動子信息
2.具體分許信息.
3.是否提供質(zhì)粒?
參考文獻
[1] Miraglia E , Nylen, Frank, Johansson K，et al. Entinostat up-regulates the CAMP gene encoding LL-37 via activation
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[2] Azimzadeh P，Olson J A，Balenga N . Reporter gene assays for investigating GPCR signaling.[J]. Methods Cell Biol,
2017:89-99.
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